应用AFM研究杂质结合和晶体质量之间的关系

AFM利用针尖与样品表面原子间的范德华力(VanDerWaalsForce)作为反馈信号,维持针尖样品间作用力恒定,同时针尖在样品表面扫描,从而得知样品表面的高低起伏。AFM的基本结构与STM相似,原子间作用力的检测主要由光杠杆技术来实现。如果探针和样品之间有力的作用,悬臂将会弯曲。为检测悬臂的微小弯曲量(位移),采用激光照射悬臂的尖端,探测器就可检测出悬臂的偏转。在扫描的同时,通过记录反馈信号即可获得样品表面的形貌。由于AFM可以在蛋白质母液中进行扫描,因此是研究蛋白质晶体形核、生长、及晶体缺陷的有力手段。

晶体质量越高,最终通过X射线衍射解析获得的结构信息也越详尽、丰富,意义和价值越大。而高质量的晶体就意味着更少的内部缺陷,所以对缺陷进行研究,并减少各种缺陷尤为重要。AFM对生物大分子晶体的研究发现了大多类似无机物的缺陷,包括零维缺陷(点缺陷),如空位缺陷和替代缺陷;一维缺陷(线缺陷),如位错;二维缺陷(面缺陷)如堆垛层错和孪晶;三维缺陷(体积缺陷),常见的包括微粒的包埋、沉淀和组合。生物大分子晶体对杂质很宽容,允许其结合。生物大分子晶体缺陷的数量和密度较大,数量级约为小分子晶体的2～4倍,这可能导致晶体的破裂和多晶的形成,进而降低晶体质量及衍射数据的可靠性,甚至阻止晶体生长。生长液的纯度是影响蛋白质晶体生长重要因素之一。母液中可能有百分之几的杂质,这些杂质显著影响晶体的溶解性、生长速度和形态,甚至直接导致晶体的破裂。杂质的结合有助于异质形核。在生长过程的早期,蛋白质溶液的过饱和度和生长速度都很大,如果杂质此阶段结合,很可能不脱离晶体表面。而随着晶体的生长,生长速度降低,杂质的结合也降低。

应用AFM研究杂质结合和晶体质量之间的关系,均得出杂质可降低晶体质量的结论。Yoshizaki等发现当加入5%的杂质,溶菌酶晶体(101)面变得粗糙,B因子显著降低;当加入10%的杂质,生长台阶消失。对比商业用和再提纯后的溶菌酶晶体的(101)面,发现前者出现了大量由共价溶菌酶二聚物才能形成的小颗粒,后者表面平滑,从而得到商业用晶体质量低于再提纯晶体的结论。Plomp等把杂质密度较高的母液换为净化后的母液,发现生长台阶极度粗糙的刀豆球蛋白晶体的表面杂质密度降低,而且螺旋位错附近的螺旋生长台阶变成带直边的多边形,X衍射分辨率从大于2.8ÜA提高到2.0Ü杂质阻止台阶生长,进而导致晶体生长的停止。对一些大分子和病毒晶体的AFM研究表明,此机制导致了大分子晶体不可挽回的生长停止。若停止生长的小晶体接种到“新鲜”的过饱和溶液,通常不会长大;然而,如果在接种之前把晶体切片,新鲜表面就会继续生长。AFM观察结果表明杂质结合的出现是籽晶播种到“新鲜”溶液时常失败的主要原因。这种机制如何使大分子晶体生长停止呢?当一开始,在溶液中形成(3D)形核,过饱和度很大,不稳定的生长速度很高。只要杂质结合时间比生长层暴露时间长,少数结合的杂质就会埋入到生长层中。长大的晶体逐渐消耗大分子浓度,溶液的过饱和度降低,生长层的暴露时间增加,那么,杂质的覆盖面积也就会增加。

随着低温AFM,高速AFM,碳纳米管探针等技术的发展,AFM的分辨率和动力学性能将进一步提高,未来的研究可能集中在以下几个方面:(1)继续晶体生长机制研究,包括分子间相互作用机制研究,如蛋白质和DNA、蛋白质之间、蛋白质和固体衬底间的相互作用,以及在各种衬底上生物大分子纳米结构的吸附,而这正是生物材料、生物加工、生物薄膜研究的基础;(2)缺陷的深入研究及相关理论的发展,为提高晶体质量提供理论指导;(3)对X射线衍射解析晶体结构的辅助作用,例如可以观察到单个分子,其精细结构有助于结构模型的构建,而单层生长台阶的高度,则提供给我们分子尺寸的精确信息。