原子力显微镜AFM在蛋白质形核过程中的应用

随着“后基因组时代”的到来,蛋白质及其复合物的结构和功能研究已成为目前生命科学领域的前沿,在蛋白质科学研究中意义重大。获取蛋白质分子结构信息的主要手段是X射线衍射技术,然而蛋白质结晶一直是该技术的瓶颈问题。因此,蛋白质结晶是蛋白质结构与功能研究中的关键环节之一,开展蛋白质结晶研究对于制备高质量蛋白质晶体,进而保证高精细结构信息的获取,具有十分重大的意义。

蛋白质晶体在物化性质上有很多的特殊性。首先,它们尺寸较大、密度较低、极度柔软、杂质水平较高;其次,对过饱和度、温度、pH值、析出剂浓度、压力等环境因素十分敏感;再次,蛋白质晶体需要维持完全水合状态,因此,晶体只能在其母液中研究。这些是一些高分辨率观察研究手段如电子显微镜难以克服的障碍。

而20世纪80年代诞生的原子力显微镜技术,则完全可以解决上述问题,因此成为可以在纳米到微米尺度范围内直接观察蛋白质晶体的有力手段。更为重要的是,在原子力显微镜扫描过程中,针尖的移动对被研究样品影响甚微,因此它是一种近似的非侵入式研究手段。由于该特点,它除了观察形貌外,还可以研究各种正在发生的动态过程,通过研究这些动态过程中的变化,并与相关的动力学条件联系,即可研究动力学过程的机理。这种能力为研究蛋白质晶体生长动力学过程提供了前所未有的理想条件。利用该技术,甚至可以观察到蛋白质分子如何进入到晶体状态的过程。可见,它对于了解和研究蛋白质晶体生长过程具有重要意义。20世纪90年代初Durbin等首次将原子力显微镜应用到蛋白质晶体生长研究,此后,人们在这个领域开展了大量的研究工作。通过原子力显微镜,不仅实现了蛋白质晶体从单个分子到小晶体尺度范围内的可视化,还观察到了蛋白质晶体生长的各种生长机制,并研究了晶体生长的动力学过程,揭示了蛋白质晶体生长与小分子晶体生长的相同之处,同时也发现了一些与小分子晶体生长不同之处。此外,还开展了对蛋白质晶体缺陷的研究。由于蛋白质晶体的缺陷是导致X射线衍射分辨率低下的关键因素,因此该工作具有十分重要的意义。本文对近年来原子力显微镜研究蛋白质晶体生长的进展进行评述,并对其未来将在蛋白质晶体学领域发挥更加重要作用做了预期。

研究形核的目的,一是让不易结晶的生物大分子形核;二是尽量减少易结晶的生物大分子形核的数量。这不仅可以满足X射线衍射的要求,而且有重要的实际意义,例如等尺寸形核的晶体作为药物时,可稳定等速度释放药效。形核过程作为蛋白质结晶的第一个过程,由于其自发性和在时间和空间上的不可预见性,所以迄今为止研究还相对较少。

蛋白质晶体生长的母液复杂而且易变,其中除了大多数小而稳定的聚集物,还有较大的亚稳液相聚集物。而后者有快速形成多层聚集物或微晶的潜能,而且会对生长晶体长序结构有所贡献。利用原子力显微镜AFM,在晶体表面已观察到上述亚稳液相聚集物的存在。实验过程中先在衬底附着少量的含有蛋白质晶体的溶液,然后放入AFM液体池内,加入大量的蛋白质过饱和溶液。在最初阶段,AFM观察到了晶体表面聚集体的沉降。Kuznetsov等认为沉降前的液相聚集物可能有两种趋势,一是形成规则的晶体,其发展取决于底层晶胞。二是形成不同于底层晶胞的微晶,并最终与底层晶体合并。从晶体分离的部分蛋白质分子可能没有溶解到溶液中,而是形成了可在晶体表面结晶的亚稳态液相聚集物。

尽管蛋白质晶体在溶液中的形核是不可预见的,然而在衬底上的异质形核还是有一定的可控性。Rong等利用原子力显微镜在涂有聚赖氨酸的玻璃底层上成功控制了溶菌酶晶体的形核方向。Kubo等利用AFM发现了溶菌酶晶体低温相(110)面倾向平行于厚的脂肪酸薄膜和空白的云母片底层,并发现其取向形核程度不但随醋酸钠浓度的增加而增加,而且显著地受pH值和过饱和度的影响。