AFM在胶原形态结构研究中的应用

1982年，IBM公司苏黎世实验室的Binning等人发明了世界上第一台扫描隧道显微镜(简称STM)，从而可在原子级分辨率水平上测量材料的表面形貌，为人类探索超微观世界的奥秘提供了有力的观察和研究工具，由此发明者获得了1986年的诺贝尔物理奖。随着STM在表面科学和生命科学等领域中的广泛应用，相继出现了许多同STM技术相似的新型扫描探针显微镜(SPM)，主要有扫描力显微镜(SFM)、弹道电子发射显微镜(BEEM)、扫描离子电导显微镜(SICM)、扫描近场光学显微镜(SN-OM)等，它们都可以在极高分辨率条件下研究不同材料的表面或界面结构。其中，Binning等人于1986年发明的原子力显微镜(atomicforcemi-croscopy，简称AFM)是最具代表性的扫描力显微镜，也是SPM家族中应用最广泛的表面观察研究工具之一。

AFM不仅能在原子尺度上对导体、半导体表面进行成像，而且能获得诸如玻璃、陶瓷等非导电材料的表面结构，并能够根据研究材料的不同需要，在真空、大气或水中实时地直接观察物体;不仅可得到样品的三维形貌图像，也可以对材料表面进行粒度、厚度、粗糙度等计算统计;不仅可以探测分子间的作用力，而且可对材料实现纳米操纵。与扫描电镜(SEM)相比，AFM纵向分辨率高，克服了必须在真空条件下测试的限制，而且检测非导电材料不需要喷金处理，更适用于生物材料研究;而与透射电镜(TEM)相比，AFM对样品损害小。因此，尽管AFM问世时间较短，其应用理论与技术迅猛发展，在高分子材料科学、生命科学以及表面科学等领域中广泛应用。

近年来，AFM技术也受到皮革领域研究工作者的关注，在研究胶原形态结构、鞣制机理、环境因素诱导的胶原聚集、皮化材料等方面，已有一些文献报道。本文首先简介原子力显微镜的工作原理和成像模式，着重对其在皮革学科领域中的应用情况进行回顾和评论。

AFM的基本原理与光学显微镜和电子显微镜不同，AFM不是采用光学或电子透镜来成像，而是利用尖锐探针在样品表面上方扫描来检测样品的一些性质。

将对微弱力极敏感的微悬臂一端固定，另一端有一微小的尖锐探针，当探针与被测样品接近时，探针与样品间发生原子间的相互作用力，这一作用力导致微悬臂发生弹性形变，光电检测系统可通过微悬臂背面反射的激光束的位移检测到这一变化。在AFM经常使用的恒力模式下，反馈系统根据检测器电压的变化，不断通过压电陶瓷调整针尖或样品的Z轴方向的位置，保持针尖—样品间作用力恒定不变，针尖和样品所被调整的Z轴距离作为Z方向的信号，再加上表征样品被扫描位置的X、Y方向信号，即可得到样品的表面形貌。AFM的图像也可以使用“恒高”模式来获得，也就是在X、Y扫描过程中，保持针尖与样品之间的距离恒定，通过测量微悬臂Z方向的形变量来成像。这种方式不使用反馈回路，可以采用更高的扫描速度，通常在观察原子、分子像时用得比较多，而不适用于表面起伏比较大的样品。根据所研究样品表面结构性质及研究需要的不同，相应的还可以选用其它操作模式，如恒梯度模式、谱学模式等，利用谱学模式可以测得力—距离曲线，从而测量探针与材料表面的各种相互作用力，得到表面定域粘弹性质的信息。

AFM的成像模式根据探针同样品间距离及作用力性质的不同，AFM主要有3种成像模式:接触模式、非接触模式、轻敲模式或称动态模式。

在接触模式中，针尖与样品间距离小于0．03nm，原子间力为排斥力，其大小为10－8～10－11N，可认为针尖始终和样品接触，在样品表面简单移动，以恒高或恒力等模式进行扫描。接触模式通常可以产生稳定的、高分辨率的图像，但是由于针尖在样品表面上滑动及样品表面与针尖的粘附力、毛细作用等，可能使针尖受到损害、样品变形，得到假象，所以接触模式一般不适用于研究生物大分子、低弹性模量样品以及容易移动变形的样品。

在非接触模式中，针尖在样品表面上方振动，探针距离样品表面上方5～20nm，始终不与样品接触，探针监测器检测的是范德华吸引力和静电力等长程作用力。这种模式虽然增加了显微镜的灵敏度，但由于针尖与样品间距较长，分辨率比接触模式和轻敲模式都低，成像不稳定，操作相对困难，通常不适用于在液体中成像，在生物中的应用也较少。

轻敲模式是介于接触模式和非接触模式之间的成像技术，微悬臂在其共振频率附近作受迫振动，轻轻地敲击样品表面，间断地和样品接触，针尖与样品间的作用力通常为10－9～10－12N。由于针尖与样品接触，分辨率几乎同接触模式一样，同时由于接触短暂，可提供针尖足够的振幅来克服针尖和样品间的粘附力，避免针尖粘附到样品上;另外由于作用力是垂直的，表面材料受横向摩擦力和剪切力影响较小。不过，这一垂直力也会使柔软或有弹性的样品表面发生变形，所以轻敲模式图象经常反映的是样品表面形貌与弹性特性的混合。轻敲模式在大气和液体环境下都可以实现:在液体中，由于液体的阻尼作用，针尖与样品的剪切力更小，对样品的损伤也更小，所以可以对活性生物样品进行现场检测、对溶液反应进行现场跟踪等。轻敲模式在高分子聚合物和生物样品的研究中应用较多。

轻敲模式的另一重要应用是相位成像(phaseimaging)，即通过测定扫描过程中微悬臂的振荡相位和压电陶瓷驱动信号的振荡相位之间的差值，来研究材料表面的不同性质。相位成像技术可以用来研究样品的表面摩擦、材料的粘弹性和粘附性等，也可以对表面的不同组分进行化学识别，比如它对于识别表面污染物、复合材料中的不同组分以及表面粘性或硬度不同的区域非常有效。它所得信息与横向力显微镜相近，但因为采用了轻敲模式，可以适用于柔软易损、粘附性强或与基底结合不牢的样品。

对于一定的试验体系，即使是轻敲模式，吸附颗粒也可能粘附到探针上，造成双针尖假象。在实际操作中，通常根据被测材料的特性以及不同的研究需要，选择合适的操作模式与成像模式。例如对柔软的胶原纤维的成像多采用轻敲模式，因为轻敲模式所用的力比接触模式低，并且摩擦力更小。

AFM在胶原形态结构研究中的应用

作为制革原料的动物皮是一种复杂的生物组织，其特有的纤维编织结构是皮革物理机械性能的基础，制革工艺过程中的化学、机械和生物作用，就是通过适度改变其组织结构并由此决定成革的性能和质量。动物皮中含量最高的成分是胶原，胶原纤维具有多级结构，胶原最基本单位是胶原分子，是由3条左旋α肽链构成的右手螺旋分子，直径1．5nm，长约280nm，5个胶原分子按照四分之一错列排列，并通过首尾重叠部位相互交联形成微原纤维，直径约为8nm，微原纤维进一步形成直径为30nm到500nm不等的原纤维，原纤维排列形成基础纤维和纤维束。AFM使得人们可以直观观察到胶原的细微结构。根据制样方法的不同，我们这里把样品分为2类，原生胶原纤维和再生胶原纤维，前者是指从动物体上取下的组织，经过去肉、脱脂等步骤，直接用于AFM观测，后者是指经过酸法、碱法或酶法分离提取出的胶原溶液，再经过一系列的处理制得的样品。

Revenko等用AFM观测了原生的鼠尾跟腱胶原纤维和再生的鼠尾跟腱胶原纤维，并与TEM、SEM测试结果比较。他们采用轻敲模式观测到的原生胶原纤维宽度约为200nm，D周期为69nm，明暗带之间高度差为16nm;重组的胶原纤维宽约90～130nm，D周期67nm，明暗带间高度差为4nm。与电镜结果比较，AFM的横向分辨率(XY方向)接近SEM，不如TEM，但是AFM具有Z方向分辨率高的优势，能够获得明暗周期高度差。Baselt等用AFM研究了原生鼠尾胶原纤维和再生牛皮胶原纤维的形态，得到类似的结果，原纤维D周期为60～70nm，明暗带间的高度差随原纤维的粗细由5到15nm不等，与TEM的结果相似，还发现在明带中有1nm深的小暗带;当将胶原纤维浸入水中测试时，D周期等结构不再明显。

利用AFM可以观察胶原纤维的顺序自组装过程。Gale等先制备了胶原溶液，然后在不同的时间间隔取样于AFM下检测，观察到牛皮胶原从胶原分子(直径1～2nm，长300～500nm)到微原纤维(直径2～6nm、长大于10μm，D周期约67nm)，再到原纤维(D周期约67nm)的顺序自组装过程。Cisneros等用AFM追踪了牛皮胶原的自组装，提出胶原分子间先相互聚集成低聚物，然后重新排列组装成微原纤维的推论。

AFM不仅可以观测胶原纤维表面形貌，而且可以对胶原进行纳米解剖，观测胶原纤维内部结构形貌，进一步测试胶原的一些性能。Wen等在获得FLS(长间距片段)型胶原纤维的表面形貌之后，利用AFM实现了对单根胶原纤维的纳米解剖，对内部结构直接成像。Strasser等不仅通过显微解剖对牛皮胶原内部结构清晰成像，并且利用AFM记录力—距离曲线，对胶原纤维外部和内部的弹性性能进行了测试。其结果显示:牛皮胶原原纤维高度为30nm，宽度为270nm，呈现清晰的明暗交替周期约78nm的条纹，解剖的深度约为原纤维高度的一半，纤维内部与外部的条纹结构相吻合，周期一致，弹性测试结果表明，原纤维内部与外部的杨氏模量相同，但是内部的黏度高于外部。

鉴于AFM可以在纳米尺度直接观察胶原的形态结构，所以近年也用于对提取胶原的形貌结构表征和鉴定，如:刘苏锐等用酶法提取猪皮胶原，在AFM下观察其为300nm长、15nm宽的纤维，由此推断提取的猪皮Ⅰ型胶原结构未破坏。我们课题组采用酶法提取的牛跟腱I型胶原的AFM图像，可以看到胶原细纤维(Φ10～30nm)在云母表面铺展排布较均匀。