AFM在植物细胞及亚细胞结构研究中的应用

染色体的结构与功能的研究一直是细胞学和遗传学中的重大课题。Winfield等(1995)首次报道了应用AFM观察植物染色体的研究。他们采用常规方法分离小麦染色体,没有经过染色和喷金处理而直接进行观察,并测量了染色体表面的高度,发现C带高135nm,且成对存在。Schaper等(2000)将场发射扫描电镜(FESEM)和AFM联用,分析有丝分裂时期的大麦染色体形态变化。液相下,AFM图像显示前中期染色表面凝聚,后期出现染色单体裂隙,末期着丝粒区域清晰可见;气相下,经过蛋白激酶K作用后的染色体表面出现网状结构。其他研究人员利用SNOM与AFM测量经荧光原位杂交(FISH)处理的大麦染色体的高度和荧光强度,取得了良好的效果(Ohtanietal.,2002;Yoshinoetal.,2002;Fukushietal.,2003;Shichirietal.,2003)。Liu等(2003)用2mol.L-1NaCl从大麦染色质中提取分子量为4和20kD的两个非组蛋白后,由AFM的图像了解到染色质的粗糙度增加,高度减小,为研究非组蛋白与DNA的关系提供了新思路。通过用15%、30%、45%三种浓度的乙酸处理大麦染色体,结果表明,30%浓度处理可以得到清晰的染色体形貌,为研究染色体有序结构创造了条件(Sugiyamaetal.,2004)。在染色体结构中,着丝粒与其它区域完全不同,并且这个区域的染色质纤维结合紧密,不易观察。为了解决这个问题,引入了一种利用显微操作技术(micromanipulationtechnique)机械伸长着丝粒的方法,实现了对着丝粒区域内染色质纤维的成像(Otobeetal.,2002)。

Butt等(1990)首先将AFM用于植物细胞的观察。他们获得了南紫薇(Lagerstroemiasubcostata)的叶片表皮及气孔的图像,由于表皮较厚,没能展示200nm以下的更多细节;而水生植物香睡莲(Nymphaeaodorata)表皮相对较薄,可以见到表皮微纤丝结构。vanderWel等(1996)用5%戊二醛固定玉米原生质体,气相下获得了清晰的AFM图像,液相下样品易碎导致成像困难,而未固定的样品则无法成像,可能是因为扫描时原生质体已经涨破或针尖对原生质体有一定的损伤;他们又将新鲜的长寿花(Kalanchoeblossfeldiana)和玉米花粉粘在双面胶带上,直接进行AFM扫描,所得图像与FESEM一致。邢树平等(2000)将AFM应用到裸子植物雪松(Cedrusdeodara)和水杉(Metasequoiaglyptostroboides)花粉外壁结构的研究中,发现雪松花粉外壁有很多球状和短棒状结构:而云杉表面则存在许多颗粒状亚单位,支持了Southworth提出的网络状模型,即花粉外壁是颗粒状结构在三维空间的一种无方向性的网状连接。扫描Lacandoniaschismatica和银杏(Ginkgobiloba)细胞核的半薄切片分别得到核膜、核孔、染色质、核仁等结构的AFM图像(Jimenez-GarciaandFragoso-Soriano,2000)。随后研究发现细胞核内存在32nm左右的颗粒,推断G期的银杏细胞核为网状,存在Lacandonia颗粒(Jimenez-Ramirezetal.,2002)。Yamada等(2002)获得了白色体和叶绿体的形貌图,并在生理缓冲液中测量表面物理弹性。在见光转换为叶绿体之前,白色体表面比较光滑坚硬,转换后表面变得粗糙柔软,白色体的粗糙度为叶绿体的20倍。Gradinaru等(2004)把AFM和双光子共聚焦显微镜(confocaltwo-photonfluorescencemicroscope)组装成多元显微镜(multiplexmicroscope),解决了AFM专一性不强、定位与鉴定困难的问题,也克服了光学显微镜分辨率不高的缺点。他们从新鲜的菠菜叶片中提取叶绿体,置于多元显微镜上,观察到未垛叠的叶绿体基粒呈规则的圆形,直径在200~1000nm之间,同时记录了对应部位的荧光强度。Kirchhoff等(2004)从形貌图上测量菠菜类囊体内膜脂双层的高度为5.5nm,高于PSⅡ三聚体(4.8nm),这种差异是由于膜蛋白的存在造成的。Fukumoto等(2005)使用显微操作技术分选日本落叶松(Larix leptolepis)原生质体中新形成的纤维, 经AFM测得束状纤丝(fibiril)和亚纤丝(subfibril)直径分别为700和170 nm。Marga 等(2005)通过实验证明细胞壁的伸长导致微纤丝的分离, 符合多网络生长假说(multi-netgrowth hypothesis)。