AFM在生物细胞研究中的应用及展望

原子力显微镜（ＡＦＭ）是生物显微技术的一个重要组成部分，可实现液体环境下活细胞高分辨率的成像与操作，为细胞生物学研究提供了新的方法。近年来，ＡＦＭ已经逐渐发展成为集样品成像、力测量及操作等功能于一体的多功能生物细胞研究平台，在细胞研究中得到了广泛的应用。在简要介绍ＡＦＭ组成与工作原理的基础上，详细阐述了近年来基于ＡＦＭ成像与力谱技术的细胞研究的发展状况。针对ＡＦＭ本身所存在的不足，介绍了ＡＦＭ与其他技术相结合的研究成果，并对ＡＦＭ在生物细胞研究中未来的发展方向进行了展望。

细胞是形貌分析中最常用的样品，目前对哺乳动物活细胞成像的分辨率被限制在５０～１００ｎｍ，无法实现细胞表面单一成分的观察。相对而言，微生物细胞表面具有良好的刚性且界限明确，通过ＡＦＭ可得到纳米级分辨率图像。ＡＦＭ可实现细胞在外部刺激或疗法作用下结构变化的动态跟踪，这对于生物医学研究具有重要意义，如暨南大学及其附属医院利用ＡＦＭ对病变、分化、药物和物理处理等作用下细胞形貌与结构的变化进行对比分析，研究疾病治疗的新方法及药物的有效性测试。中国科学研究院研究发现通过对人体红细胞形貌变化的分析可实现早期诊断中缺铁性贫血与地中海贫血的区分。ＡＦＭ对微生物细胞成像最初是在空气中进行的，随着技术的进步逐步发展为在液体环境下对微生物细胞形貌的观察。Ａ．Ｇｉｌｌｉｓ等人通过对多种不同水平的苏云金杆菌进行研究发现，利用ＡＦＭ观察空气中微生物细胞结构与定量分析鞭毛尺寸，既简便又可靠；Ｇ．Ａｎｄｒｅ等人利用ＡＦＭ对溶液中极化分布的磷壁酸作用下的植物乳球菌形貌变化进行研究，发现磷壁酸在控制细胞壁的形貌上起着很重要的作用。此外，通过ＡＦＭ实时观察病原体与药物间的相互作用可以深入解析抗体与药物的作用机理，为生物药学研究提供重要的参考。

细胞的固定是制约活细胞高分辨率成像技术发展的一个难点问题，固定方法的不恰当会导致细胞很容易在探针的作用下脱落或者影响到细胞的活性。已有的细胞固定方法包括：静电法、共价键法、捕获以及黏附等，其中捕获与黏附的方法相对而言在活细胞应用中更为理想。Ｒ．Ｄ．Ｔｕｒｎｅｒ等人利用ＡＦＭ对微孔滤膜捕获的金黄色葡萄球菌进行动态过程观察发现：在细胞固定状态良好的情况下，成像分辨率可达到接近分子的级别。

ＡＦＭ成像具有很高的空间分辨率，但是成像速度（约１ｍｉｎ）一直是制约其发展的重要原因。在原子力显微镜出现不久，Ｃ．Ｆ．Ｑｕａｔｅ研究小组就提出了快速ＡＦＭ的研究理念，经过２０多年的研究发展，在Ｍ．Ｊ．Ｍｉｌｅｓ研究小组、Ｐ．Ｋ．Ｈａｎｓｍａ研究小组及Ｔ．Ａｎｄｏ等人三个研究团队的推动下，ＨＳ－ＡＦＭ技术已经逐步成熟起来。Ｔ．Ａｎｄｏ团队在２００８年已经研究出能够用于蛋白质分子研究的全套ＨＳ－ＡＦＭ系统。Ｍ．Ｊ．Ｍｉｌｅｓ等人利用音叉形的扫描器实现了目前所能达到的最高成像速率（１３００帧／秒），但是其应用受到了很大的限制。目前一般的ＨＳ－ＡＦＭ技术能够达到２５帧／秒的成像速率，且反馈带宽已经超出了１００ｋＨｚ的范围，可实现生理条件下生物分子结构变化及动态过程的跟踪成像。在现有ＡＦＭ的设备基础上，扫描速率已经达到了一个瓶颈，因此，近年来关于ＨＳ－ＡＦＭ的研究重点开始转向设备的改进、应用范围及功能的扩展，其研究领域包括２Ｄ晶体系统、单个蛋白、蛋白质自组装过程、ＤＮＡ结合蛋白、非生物研究中的操作与成像等。如Ｃ．Ｉｇｎａｃｉｏ等人利用ＨＳ－ＡＦＭ对细胞膜表面蛋白进行动态分析，研究生物膜结构与动态过程之间的联系。目前，用于进行活细胞成像的ＨＳ－ＡＦＭ还没有完全建立起来，但是已经有相关研究开始利用ＨＳ－ＡＦＭ对单个细胞的动态结构变化进行实时跟踪成像。

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