原子力显微镜技术应用于单个生物大分子压弹性研究
单个生物大分子力学性质已经成为一个新兴的研究领域,近几年来由于单分子技术的不断发展,这个领域取得了很多突破性的进展。本文介绍了基于原子力显微镜技术的几种单分子压弹性测量技术及这些技术的具体应用,同时也简要阐述了这些技术的局限性。另外对这个领域的发展也进行了初步地探讨。
随着纳米测量技术的发展(如纳米磁珠、光镊子、原子力显微镜等),尤其是皮牛pN(10-12牛顿)测量技术的出现使人们能够研究单个生物大分子(DNA和蛋白质分子)的动力学行为,且能对其进行直接操纵,从而在单分子水平上对DNA和蛋白质的力学性质(弹性或柔性)进行研究。近年来单个生物分子力学性质的研究引起了人们很大的兴趣。这是因为从物理学角度看,单个分子的弹性是否与宏观物体的弹性相同是一个值得探讨的问题;从生物学角度看,生物大分子一般都具有一定的柔性,即在微小的外力作用下会发生构像的改变,从而导致其功能的变化,单分子弹性的研究将有助于揭示其结构与功能之间的动力学规律,探索潜在的生物学特别是遗传学的意义;此外,生物大分子是一类颇受重视的天然纳米材料,从材料科学角度看,单分子力学性质的研究对于纳米器件的组装和连接也十分重要,它将直接影响纳米器件最终的工作性能。
目前,在利用原子力显微镜技术研究单个生物大分子力学性质方面,大量研究工作主要集中在单分子的拉伸特性上,通常采用的方法是将一个大分子的一端固定在修饰过的衬底表面,用原子力显微镜的针尖拉伸另一端,有关单分子拉伸特性已经报道了大量令人兴奋的研究成果,同时也有很多优秀的评述文章,其中最有代表意义的是对单个DNA分子的拉弹性的研究(stretchingelasticity)。最近有不少研究组开始探索单个分子的压缩特性,他们通常采用的方法是用原子力显微镜的针尖去压分散在衬底表面的单个分子。在本文中,我们首先评述基于原子力显微镜技术的几种单分子压弹性测量方法及其具体应用,然后简要阐述这些方法在研究单个DNA分子压弹性时的局限性。
原子力显微镜在接触模式下针尖与样品的作用力可以很精确地控制,通常采用接触模式的力曲线(force2distancecurve)可以较好地测量柔软样品的压弹性。首先在硬样品(如玻璃或云母)的表面做一条力曲线(区域2),然后将要研究的单分子样品取代硬样品重新做力曲线(区域3),此时不能改变任何实验条件。针尖与样品间相互作用力F可根据胡克定律算出:F=k×d,其中k,d分别是悬臂弹性系数及悬臂的偏折量(软样品表面的凹陷量可由在软的和硬的样品表面获得的力曲线相减得到)。根据所用针尖的不同,可用Hertz公式计算出样品的弹性模量:d3=9(1-μtip)2F2P(16RE)其中μtip,R,E分别是样品的泊松系数(一般软样品取1P3),针尖半径及样品的弹性模量。
利用接触模式下的力曲线在单分子力学性质的研究中已经做了大量的工作,得到了在纳米尺度下许多与宏观状态下不同的特性。在早期的生物分子研究中,实验大多是在液体下进行的,这样比较接近生物分子的生理状态。Radmacher等人研究了液体下分散在云母表面的单个溶菌酶分子的压弹性,用赫兹模型计算到它的弹性模量是015±012GPa,这个结果与其宏观晶体的压缩率较接近(012～1GPa),同时在做力曲线时他们比较了在云母上与溶菌酶蛋白分子上针尖的Liftoff值,得到蛋白分子的粘度(viscosity)为800±400pN。魏青青等人也用力曲线的方法研究了不同功能状态的兔骨骼肌ryanodine受体P钙释放通道(RyR1)的弹性。首先对处于抑制状态的RyR1进行测量,接着用5mmolPL的AMP和50μmolPL的Ca2+将其激活,发现它的弹性模量有较明显的升高,然后将缓冲液换为无AMP和Ca2+的抑制性溶液后,发现其弹性模量又有较明显的下降。但采用其他抑制剂(如钌红)和激动剂(咖啡因)时,RyR1的弹性没有明显的变化。另外他们也注意到每次实验测量得到RyR1的弹性模量的误差很大,这可能是由于在液态下针尖与样品的作用力要比大气中复杂而且热漂移较大引起的。近来许多研究组也经常在大气中测量单分子的压弹性。Zhao等人用导电原子力显微镜在空气中测量了单个azuin蛋白分子的弹性[20],计算得到弹性模量为14GPa。实验发现其应变-应力曲线几乎是线性的而且通过原点,说明这是一种弹性形变。另外Tsukruk等人也在大气环境中比较了单个分枝分子(singledendriticmolecules)与其聚合体的弹性差异[21,22],发现聚合体的弹性(250±30MPa)要明显大于单体的弹性(150±25MPa),他们认为这可能是由于聚合体形成的网状结构使其变得较硬。
单个生物大分子力学性质的研究是一个很重要的问题,因为它与诸多的生物学过程密切相关。近年来由于单分子技术的不断发展,这个领域已经取得了许多突破性的进展,单分子力学已成为生物物理的一个热点问题。但同时我们也看到还有许多问题没有得到解决。譬如,作为一个细长的柔软分子,DNA的弹性主要由三个基本弹性组成:纵向(沿双螺旋方向)拉伸弹性、横向(沿直径方向)压缩弹性以及扭转弹性。尽管人们在单分子压弹性研究方面已经做了很多努力,取得了大量的研究成果,但据我们所知,作为单分子压弹性研究的试金石,单个DNA分子压弹性的数据至今还没有得出。这是因为DNA分子的直径只有约2nm,为了在小力区(F<015nN)精确测量其压弹性,在其上施加的作用力与相应的形变测量的精度必须分别达到～011nN和～011nm,这对目前的原子力显微技术是很大的挑战:
(1)采用接触模式下的力曲线方法,如果在液体下进行实验,针尖要受到很大的粘滞力,而且液体下的热漂移很严重;如果在空气中测量,由于Jump2into2contact(～110nm)现象的存在,尽管人们已经用了很多精力包括利用针尖修饰等各种途径去尽量减小这个值,可至今还没有完全克服,因此很难精确测量DNA分子的初始形变。
(2)利用TM2AFM下的力曲线,在液体下针尖与样品的作用力很复杂,不能判别是否为斥力相互作用;而在空气中,我们在Force2Volume图上观测到了DNA分子的反差,由于很难判别针尖与样品的初始接触点而不能定量地计算它的形变。
(3)传统的TM2AFM需要较大的traceforce(～110nN)才能稳定成像,此时已经把生物分子压得很扁。
(4)利用Jumpmode方法可以很好地控制针尖与样品间的作用力(～50pN),但必须采用软针尖,此时热扰动会引起大约110nm的针尖振幅波动,因此很难精确地得到DNA分子的径向形变。目前单分子压弹性测量的各种方法还有其各自的局限性,与其他传统的测试方法相比还不够成熟。尽管如此,我们依然欣喜地看到许多物理学家、化学家、生物学家及材料科学家都被吸引到这个新兴领域,这势必极大地推动该领域的发展。目前人们正在不断地完善各种基于原子力显微镜技术的单分子力学测量技术,如把它与单分子荧光、单分子拉曼光谱结合起来就很可能给出更新更有说服力的结果。另外,在发展单分子实验技术的同时,正在努力发展各种新的理论模型,将实验与理论模拟相结合去揭示许多单分子实验现象中的一些本质规律。我们期待随着单分子技术的不断发展,实验精度的不断提高,能够早日提供小力区DNA分子的压弹性模量,结合其拉弹性与扭弹性的数据,可以给出DNA分子力学性质的完整描述。总之,单分子力学是蓬勃发展的新兴的交叉领域,当人们积累了大量的单分子力谱的信息后,对生命现象中一些基本过程就会有一个更深的认识;同时单个生物大分子作为天然的纳米材料,深入了解其力学性质对纳米器件的设计与制造也有很重要的意义。