原子力显微镜在细胞固定技术中的应用

关于AFM仪器及方法方面的综述已很多，在此只对其作简要介绍.AFM是一种以检测探针与样品间相互作用为特征的扫描力显微镜，主要有附有针尖的微悬臂、压电扫描器、激光与光电检测器及反馈控制系统等4部分构成.力敏感弹性微悬臂一端固定，另一端附有一微小的针尖，当针尖对固定在压电扫描器上的样品进行扫描时，随距离变化的针尖–样品间相互作用力会引起微悬臂变形，由激光源发出的一束激光照射到微悬臂的背面，并被反射到光电检测器上，通过反馈控制系统即可记录样品的表面形貌或样品–针尖间作用力等方面的信息.随着原子力显微镜技术的迅猛发展，它在细菌吸附研究中的应用日趋广泛，主要包括测定细菌表面形貌以及细菌与固相表面间的作用力.

运用AFM研究细菌吸附时，现有文献中使用了多种固定细菌细胞的方法.根据细菌固定的位置，可将固定方法分为两类：第一，细胞固定在支持物上，探针可以是氮化硅或硅探针，抑或是胶结有微米尺寸珠子的微悬臂，由于制作均质性探针受到材料的限制，因此研究细菌与不同固相界面间的相互作用也将受到制约；第二，细胞固定在探针上，即细胞探针，此种固定方法弥补了第一种方法的不足，可用于探究细胞探针与任何感兴趣的固相表面间的相互作用，但该技术的缺陷是细胞探针表面较大，成像的分辨率低，力测定值是探针与研究表面间微米水平接触区域的力效应的平均值，且很难获得精确的探针半径及细胞或胞外大分子的取向.另外，两类细胞固定技术都需要保持细胞的自然状态，且细胞固定力大于细胞与界面间作用力.

AFM测定的一个基本要求是样品必须粘附到固体底物上.对微生物细胞样品来讲，由于其有明确的形状且在底物上没有展开的趋势，因此细胞与底物间的接触面积非常小，扫描探针常常导致细胞与底物发生分离.虽然对细胞进行风干处理可以解决上述问题，但风干处理同时也引起细胞表面分子的变性.为原位固定细菌细胞，许多研究者利用聚乙烯亚胺、氨基硅烷、多聚-L-赖氨酸或明胶前处理底物，或直接利用微生物细胞自身分泌的胞外聚合物，均可把细胞强烈粘附于底物上.另外，也可机械固定细胞于琼脂或微孔膜中，琼脂被用作是软的、易变形的固定基质，可用于细胞生长过程的可视化研究，而微孔聚合物膜可机械捕获与孔大小相近的球状细胞，允许重复成像而又不引起细胞分离或受损.微孔膜机械捕获技术的优点在于其简单直接和不涉及化学固定及干燥，缺陷在于其只能固定球状细胞而不能固定杆状细胞.在一个细胞固定方法的对比研究中发现，微孔膜机械捕获细菌细胞是最可靠的固定方式，而细菌在修饰底物表面上的物理吸附促进了细胞表面结构的重排，戊二醛处理导致细胞表面性质的变化.总之，对于一个新系统，应该评估多种固定技术的优劣，最合适的方法往往取决于系统的细胞类型和环境条件.

细胞直接连接于探针后，研究者能够探测细胞与多种固相表面间的相互作用.根据已有的研究结果又可把细胞探针分为单细胞探针和多细胞探针.在多细胞探针方面，最初，研究者直接连接戊二醛交联处理后的细菌细胞于聚乙烯亚胺包被的探针上.然而，戊二醛处理很可能会影响到细胞表面的结构、性质及吸附特性.而Razatos等基于戊二醛处理前后细菌的zeta电位及接触角均保持不变，认为戊二醛处理不影响大肠杆菌（Escherichiacoli）的吸附特性.Lower等在研究细菌与矿物相互作用时，建立了制作生物活性探针的方法，即物理方法吸附细菌于多聚-D-赖氨酸包被的玻璃珠上，而后通过少量的环氧树脂把包被有单层细胞的微珠粘附到微悬臂上.后续的研究发现，1-十六烷硫醇或多聚-L-赖氨酸可通过直接修饰微悬臂上的针尖而将细胞固定于探针上.在单细胞探针方面，尽管已有单个真菌探针制作成功的实例，但真菌细胞大小明显大于细菌细胞，利用微量的胶粘附单个细菌于悬臂上并非易事.Lower等虽然能通过多聚-D-赖氨酸将单个细菌细胞连接于微悬臂上，但作者也认为这种直接连接技术是相当困难的，并提出光镊或纳米镊等技术的进步能显著推进单细胞探针的发展.