原子力显微镜在金属蛋白酶构象中的应用

血小板黏附到受损的血管壁上,是止血与血栓形成中的重要过程。血管性血友病因子(VonWillebrandFactor,VWF)与血小板受体GPIbα间的相互作用,介导着血小板的附着黏附以及滚动黏附过程,在血小板初始黏附阶段起着非常重要的作用。

VWF的活性与其分子大小有关,分子量越大,其活性越强。血管性血友病因子水解蛋白酶ADAMTS13(Adisintegrinandmetalloproteasewithathrombospondintype1motifs13)通过酶切VWF-A2结构域中心的Tyr1605-Met1606肽键,对VWF的大小进行调节,从而调节VWF的活性。目前有研究表明ADAMTS13存在低亲和力的闭合构象和高亲和力的打开构象；ADAMTS13中的spacer结构域中5个特定的位点发生突变(R568K/F592Y/R660K/Y661F/Y665F),称之为功能增强型突变体(GOF),其酶切活性相较WT增加约2.5倍；此外,低pH可以增强ADAMTS13的活性,Ca~(2+),Mg~(2+),Zn~(2+)等二价金属离子亦可调节ADAMTS13酶切VWF-A2的活性。ADAMTS13在上述各种条件下的酶切活性的变化是否是与其自身的构象发生变化有关?ADAMTS13分子是否存在多种构象,低pH是否诱导ADAMTS13构象发生改变,以及二价金属离子是否会影响ADAMTS13构象?

本研究利用原子力显微镜AFM分别对不同条件下WT-ADAMTS13及GOF-ADAMTS13进行形态学扫描。数据显示,不同条件下,WT-ADAMTS13和GOF-ADAMTS13的体积(Volume)、投影面积(ProjectedArea)、最长径(Maximumlength)相比,区别并不明显。但是,WT-ADAMTS13蛋白颗粒的纵横比值(AspectRatio)显著性地小于GOF-ADAMTS13的纵横比。对纵横比数据进行柱状图分布并进行高斯函数拟合,WT-ADAMTS13的纵横比呈双峰分布,GOF-ADAMTS13的纵横比呈三峰分布。我们将每个峰定义为不同的类型(stateI,stateII,stateIII),我们提出stateI是“封闭”的构象,stateIII是“开放”的构象,stateII是中间态构象。数据显示,在pH6和pH7.5条件下,WT-ADAMTS13采用两种不同的构象状态(stateI,stateII),而在GOF-ADAMTS13中观察到另外一种状态(stateIII)。与pH7.5相比,WT-ADAMTS13的stateII和GOF-ADAMTS13的stateIII的百分比在pH6增加,WT-ADAMTS13的stateI和GOF-ADAMTS13的stateI和stateII降低,表明低pH可以诱导ADAMTS13呈现更加开放的构象。当用EDTA螯合金属离子后,ADAMTS13stateII和stateIII两种构象分布明显增加,而对GOF的构象分布影响不大。当再次加入不同的二价离子,我们发现,加Ca~(2+),Mg~(2+)后,WT-ADAMTS13的stateI明显增加,构象变得更为紧凑；GOF在加入Mg~(2+)后,stateI亦明显增加,说明Ca~(2+),Mg~(2+)可以稳定ADAMTS13的构象；Zn~(2+)对两种蛋白的构象均无影响,说明Zn~(2+)并不是通过影响ADAMTS13的构象而使其活性发生变化。

本研究通过对不同条件下ADAMTS13的构象数据进行统计分析,归纳提出ADAMTS13存在3种构象状态,更加清晰的阐明了ADAMTS13在不同条件下发挥酶切活性时存在的多种构象,且ADAMTS13的构象受二价金属离子调控,这些发现进一步加深了我们对ADAMTS13水解VWF,调控其活性的理解,同时为ADAMTS13相关血栓疾病的理解及抗血栓药物的研发提供指导意义。
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