原子力显微镜单分子力谱法以其独特的优越性在生物单分子相互作用的研究中发挥着十分重要的作用

在单分子水平研究生物分子相互作用的分子机制，对于深入了解生物分子的特异识别、生化过程以及分子结构与功能的关系具有重要意义，是目前生物、化学、物理交叉领域的一个前沿方向。原子力显微镜单分子力谱法以其独特的优越性在生物单分子相互作用的研究中发挥着十分重要的作用。原子力显微镜(atomicforcemicroscopy，AFM)是1986年由美国IBM公司的Binnig和Stanford大学的Quate等发明的。由于AFM具有原子级的高空间分辨率(横向分辨率可达0.1nm，纵向分辨率可达0.01nm)，制样方法简单，能在接近生理环境的条件下(如溶液中)操作，利用它对生物样品进行高分辨成像，已成为生物学研究的常用技术，广泛应用于结构生物学、分子生物学、细胞生物学等各领域。Lee等报道利用AFM皮牛级的测力灵敏度来研究生物分子间的非共价作用(一般认为单对生物分子间的非共价作用力为几十到几百皮牛)，使得传统热力学研究方法无法实现的单分子水平上分子间相互作用力的测定成为可能。此后，用于研究生物分子相互作用的原子力显微镜单分子力谱法(singlemoleculeforcespectroscopy)迅速发展起来。

最早利用AFM单分子力谱研究的是链霉亲和素/生物素及亲和素/生物素体系，它们被认为是最强的非共价结合分子对，其离解常数达到10-15mol/L。Lee等用生物素修饰的AFM针尖与链霉亲和素修饰的云母测定了单对链霉亲和素/生物素相互作用力，发现其大小比用链霉亲和素溶液封阻后的针尖-基底非特异作用力大3－8倍，证实了单分子力谱研究单对生物分子相互作用的可行性。随后人们应用AFM单分子力谱研究了大量生物分子配体/受体的结合，下面仅举几例介绍近年来单分子力谱在研究蛋白质/蛋白质、蛋白质/DNA相互作用，及蛋白质去折叠等方面的应用进展。蛋白质/蛋白质的相互作用单分子力谱法建立后便广泛用于表征抗体/抗原分子的亲合力。

Hinterdorfer等研究了白蛋白抗体与抗原的相互作用力，并改进了蛋白质的固定方法，通过一段PEG高分子聚合物链将蛋白质与表面相连，这样不仅增加了抗体抗原的空间自由度，而且能从力-距离曲线图上将其特异性相互作用与针尖和基底的非特异性相互作用力区分开来，成为目前固定蛋白质的常用方法。他们进一步用修饰了抗体的针尖对抗原样品扫描，发展了将AFM测力模式和扫描成像相结合的识别成像技术。采用交变磁场驱动表面被磁化的AFM微悬臂，可同时得到成像点的图像信息与分子间相互作用力，即同时获得高分辨的形貌像和识别像，克服了AFM成像只能给出分子的形状和大小信息的局限，使得AFM对成像分子的种类和成份具备一定的识别能力。抗体与抗原的相互作用在免疫反应的研究中有重要价值。

Kim等研究了抗微生物肽对脂多糖(LPS)和免疫蛋白(脂多糖结合蛋白LBP和CD14)间相互作用的影响。脂多糖结合蛋白LBP和受体蛋白CD14同LPS的结合可触发败血症性休克引发的免疫响应，但具体机制仍不清楚。测定针尖上固定的LBP蛋白和基底上脂双层生物膜中CD14的相互作用力，发现LPS存在下形成LPS-LBP复合物后与CD14间的结合力明显高于LBP和CD14间的结合力，且LPS的糖链区越长，结合力越大，说明LPS尤其是其糖链区在LBP与CD14的结合上起着重要作用。同时发现抗微生物肽多粘霉素B能特异性地抑制LBPLPS和CD14的结合。蛋白质/DNA的相互作用　通常利用AFM成像可观测蛋白质/DNA的结合。我们研究组较早报导了用AFM单分子力谱定量地表征蛋白质与DNA的结合力，如发现新型蛋白探针aptamer与蛋白质的结合强于抗体/抗原等。最近，Krasnoslobodtsev等[30]研究了DNA限制性内切酶SfiI与双链DNA复合物的单分子力谱，推测SfiI与双链DNA结合形成能瞬间分离的动态复合物。SfiI特异识别的DNA序列中有一段间隔序列，它不与SfiI结合，但其序列的改变却能改变蛋白质/DNA复合物的解离速度，从而影响SfiI酶的切割速度。了解转录因子与其DNA元件的相互作用是研究基因表达和调控的基础。我们研究组建立了利用单分子力谱研究转录因子与DNA启动子相互作用的方法，并应用于检测多种新发现的植物转录因子与其DNA元件DRE和ERE的结合，结果表明AFM在测定转录因子与其DNA启动子作用力方面具有很高的灵敏度：转录因子DNA结合域中单个关键氨基酸的突变或者启动子核心序列中单个碱基被其他碱基取代，都使得两者的结合力和结合几率大大减弱。在此基础上我们进一步研究了单分子作用力大小与转录因子生物学功能的联系，如研究水稻TINY蛋白及两种单氨基酸突变的突变体与DRE元件的相互作用力，AFM单分子力谱的结果表明其中一种突变体不与DRE结合，另一种能与DRE结合，但结合力小于野生型TINY。同时，用酵母单杂交实验检测TINY及两种突变体的基因激活活性，结果显示结合力越强的转录因子激活下游基因的表达越高。因此，单分子力谱测得的作用力大小可与其基因调控水平相关联。与生物学研究中通常采用的凝胶电泳等方法相比，AFM具有耗样量少、制样简单、快速、灵敏等优越性，有望成为表征转录因子、确定其DNA响应元件和进行功能基因组研究的新工具。

蛋白质的去折叠AFM单分子力谱也可用于分子内相互作用的研究，如将蛋白质、DNA等生物大分子的两端分别固定于AFM针尖和基底，进行“单分子拉伸实验”，研究这些生物大分子的机械性质和折叠/去折叠过程。许多功能蛋白依靠分子内的各种相互作用维持其稳定的三维结构，对溶液中具有一定构象的蛋白质进行拉伸，可以得到蛋白质解折叠的势能图，分析蛋白质去折叠过程中的构象变化。

通过对单个纤维蛋白原的拉伸从微观角度分析血凝块机械性质的分子机理。纤维蛋白原是血凝块中主要成份纤连蛋白的前体，激活后组装成纤连蛋白纤维，形成具有一定弹性的血凝块网络结构，以起到止血作用。用AFM拉伸线性的纤维蛋白原寡聚物，得到锯齿状的去折叠力曲线，表明纤维蛋白原的三链卷曲螺旋结构中每个卷曲螺旋独立地去折叠。与肌球蛋白的双链卷曲螺旋不同，后者在去折叠后可快速重新折叠，而纤维蛋白原三链卷曲螺旋去折叠后的重新折叠可忽略不计，这种区别是由纤维蛋白原的卷曲螺旋结构和蛋白本身的结构决定的 。